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| 導讀 | 盡管源自化膿鏈球菌（SpCas9）的個且常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有顯著的特異性，但除了理想的基因剪切和復制之外，已觀察到不同程度的脫靶效應（OTE）。這未免讓研究者感到無所適從，由此，如何避免脫靶效應成為了一個重要議題。 |
距離作為基因組編輯工具僅僅5年，CRISPR幾乎就成為了*的技術。從一開始作為細菌切除入侵病毒DNA的方式，到現(xiàn)在，CRISPR已經(jīng)引發(fā)了關于動物模型、高通量篩選、轉基因生物和基因治療的一系列討論。
所有的一切都在以令人震撼的速度增長。誠然，CRISPR并非*，但它的優(yōu)點太多，涉及到其可編程并適用于無數(shù)生物、細胞類型和眾多研究。截止2018年，已經(jīng)發(fā)布了超過2500篇CRISPR的論文。可以說CRISPR充滿無限的可能，這也許就是它具有讓人難以抵抗的魅力所在。
基于此，越來越多的科研人員需要操作CRISPR實驗。然而，盡管源自化膿鏈球菌（SpCas9）的個且常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有顯著的特異性，但除了理想的基因剪切和復制之外，已觀察到不同程度的脫靶效應（OTE）。
這未免讓研究者感到無所適從，由此，如何避免脫靶效應成為了一個重要議題，以下是一些CRISPR實驗設計的策略，助你實現(xiàn)脫靶效應小化。
選擇合適的靶基因和宿主細胞
在規(guī)劃基因組編輯實驗時，要問的個也許是基本的問題是目的基因是否適合預期的基因編輯操作（即刪除、插入或突變）以及特定的細胞環(huán)境（細胞類型和細胞系等）。
丨靶基因的選擇
首先，確定目標目的基因是否在宿主細胞中表達以及它是否對細胞活力是必需的。雖然已經(jīng)確定了一組“細胞必需基因”，但有些基因依賴于背景，因此目的基因在特定細胞系中的必需性可能仍需要進一步確定。
其中一個方法是根據(jù)siRNA敲低實驗的信息，但在某些情況下，細胞可能會在必需蛋白質水平降低的情況下也能存活；此外，小鼠基因敲除（KO）數(shù)據(jù)的表型讀數(shù)的也可以檢查目的基因的必需性。
然而，通常很難區(qū)分生物體發(fā)育和細胞存活本身所需基因，一個物種中基因的必需性可能也無法轉化為另一個物種的必需性。一些免費的在線工具應運而生，有助于研究者進行相關的分析。
例如，來自華中科技大學、第四軍醫(yī)大學和同濟大學等機構的研究人員建立了一個在線分析細胞重要性的OGEE™數(shù)據(jù)庫。
OGEE™分析界面截圖（圖片來源：Nucleic Acids Research）
丨細胞的選擇
對細胞（原代細胞、hPSC、iPSC或細胞系）信息的了解將有助于確定特定研究的適當實驗策略，例如具體操作細胞與研究疾病的生理相關性（組織起源和/或分化狀態(tài)）。
對于某些多核的細胞類型如骨骼肌細胞和破骨細胞，和攜帶染色體異常（包括缺失，重復或易位）的許多癌細胞、hPSCs / hESCs /iPSC以及永生化細胞系，使所有等位基因實現(xiàn)有效突變在技術上具有一定的挑戰(zhàn)性。
另外，在設計實驗方法時，細胞的遺傳穩(wěn)定性是需要考慮的重要因素。由于自發(fā)突變和其他基因組影響，特定細胞系的基因組序列不一定與給定基因的公開參考序列相同。因此，應當跨越目的基因區(qū)域進行測序以鑒定可能具有干擾gRNA結合或CRISPR結果的序列偏差。
鑒于DNA損傷修復的缺陷是許多形式的人類癌癥的基礎，源自此類癌癥患者的細胞系將積累更多突變并具有更低的基因組穩(wěn)定性。例如，長期以來報道來源于患有惡性人淋巴細胞個體的細胞系具有比來自正常個體的細胞系更高的突變頻率；與來自健康供體的細胞相比，來自患有范可尼貧血和共濟失調-毛細血管擴張的患者的B淋巴母細胞樣細胞系的突變率分別為30倍和4倍，已知這兩種疾病都是由涉及DNA損傷修復的基因突變引起的。
選擇合適的宿主細胞系時要考慮的另一個重要方面是它的細胞克隆。雖然許多細胞系初來源于純種群（即克隆細胞），但自發(fā)突變以及表觀遺傳變化可能隨著培養(yǎng)過程的細胞傳代而積累。因此，較低的傳代細胞總是優(yōu)于培養(yǎng)較長時間的細胞。
根據(jù)GSK研發(fā)人員的經(jīng)驗，陣列比較基因組雜交（aCGH）加上SNP基因組分析是一種簡單快捷的確定細胞是否適合用作研究對象的方法。aCGH檢測染色體結構和數(shù)量的改變，而SNP分析允許檢測多倍性、雜合性缺失等。當組合時，這些技術提供關于細胞系同源性和染色體重復/缺失的信息，因此提供關于位于特定區(qū)段基因的等位基因拷貝數(shù)的信息。此外，還可以對研究中的細胞系進行其他類型的分析，例如STR、FISH和核型分析。
小化CRISPR脫靶效應的策略
丨適當?shù)膅RNA設計
正確選擇用于將Cas9核酸酶導向靶基因的指導RNA（gRNA）是在CRISPR基因組編輯中減少OTE的基本步驟之一。
有許多不同的軟件工具可用于gRNA的設計，原先大多數(shù)程序基于靶DNA選擇性對gRNA進行排序以對CRISPR/Cas9的脫靶效應進行預測，但許多較新的程序還包括考慮其他因素的算法，例如目標切割效率、PAM序列等。
目前，可用的gRNA設計工具包括但不限于：
DeepCrispr
Elevation
Benchling
CRISPRscan
CHOPCHOP
GuideScan
gRNA設計在線
此外，還有支持CRSIPRi/CRISPRa gRNA設計的軟件程序
對于研究者，這么多工具可供選擇的同時，可能也會造成選擇困難。但通過2種或3種不同的工具，然后選擇在每種工具中得分始終較高的gRNA可能是有益的。還有一種選擇是，Addgene公司開發(fā)的CRISPR Software Matchmaker，它可幫助科學家選擇適合其項目需求的軟件
（圖片來源：Addgene）
丨核酸酶的選擇
核酸酶Cas9能影響切割靶基因的效率和度，是限制CRISPR發(fā)揮巨大潛力的主要問題之一，為此科學家設計出了SpCas9的一系列變體。
值得注意是SpCas9-HF1、eSpCas9（1.1）和隨后設計的超變體HypaCas9。這些高保真的SpCas9核酸酶變體，尤其是HypaCas9，在研究中表現(xiàn)出來顯著減少的OTE，同時保持與原始版本SpCas9相當?shù)木庉嬓省ｎ愃频兀硪环NSpCas9變體“Alt-R S.p. HiFi Cas9”，源自易錯PCR誘變的功能篩選，據(jù)稱具有顯著降低的OTE，同時保持了目標效率。
此外，科學家還通過其它策略實現(xiàn)了OTE的降低，包括使用配對的gRNA將切口酶Cas9或dCas9-FokI融合蛋白引導至靶向位點。每種方法都依賴于通過一對gRNA識別兩個位置緊密的序列以切割兩條DNA鏈，因此在非靶位點編輯的可能性要低得多。
為了突破PAM序列的限制，其它研究人員使用分子進化設計了一系列的SpCas9的工程化變體，包括xCas9、SaCas9、KKH saCas9等。據(jù)報道，這些工程化變體除了具有增加的靶點選擇范圍外，還保持高靶向效率和特異性。
核酸酶的選擇（圖片來源：Journal of Biotechnology）
丨限制核酸酶的暴露時間
CRISPR核酸酶在宿主細胞內保持活性的時間長短是導致OTE的另一個重要因素。Cas9和gRNA的不同表達水平和持續(xù)時間具體取決于所用的遞送方法。
在許多情況下，穩(wěn)定且組成型表達Cas9的細胞系已用于CRISPR實驗，雖然Cas9的這種強烈和持續(xù)的表達提高了靶基因編輯的效率，但是可能同時增加了OTE，因為Cas9核酸酶的持續(xù)和高水平表達促進了gRNA和靶標錯配的耐受性。
當慢病毒（LV）用于產(chǎn)生表達Cas9的穩(wěn)定細胞系時，使用較高感染復數(shù)（MOI）將導致更高水平的Cas9表達，但同時也導致更高水平的不期望的病毒整合事件。為了減輕這種影響，Ortinski及其同事設計了一種用于遞送Cas9和gRNA基因的整合酶缺陷型慢病毒載體，這促使OTE水平顯著降低，同時保持了相當?shù)倪f送和靶向編輯效率。
除此之外，許多其他方法也可以減少Cas9暴露的持續(xù)時間或水平。例如：使用細胞滲透性化合物激活的Cas9融合體，從而通過添加細胞滲透性化合物來穩(wěn)定CRISPR基因組編輯并且減少OTE；Cas9活性也可以通過使用其天然蛋白質抑制劑來調節(jié)，如衍生自單核細胞增生李斯特菌前體的AcrIIA4。
在質粒或病毒表達構建體中，通過Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）復合物將CRISPR核酸酶遞送到宿主細胞中具有顯著的優(yōu)勢。據(jù)報道，除了與轉染DNA或病毒構建體相關的細胞毒性降低，易于調節(jié)核酸酶劑量以及節(jié)省載體生產(chǎn)時間外，使用RNP能減少OTE，因為其具有快速轉換率。而當使用Cas9 mRNA時，也報道了降低的OTE。
然而，使用RNP也可以觸發(fā)某些細胞中的先天免疫反應，導致CRISPR實驗中細胞毒性增加，使用化學修飾或磷酸酶處理的gRNA可以幫助減輕這些反應并增加細胞活力。
實驗設計中控制OTE的策略（圖片來源：Journal of Biotechnology）
盡管可以采取措施減少OTE，但現(xiàn)有技術可能無法避免。出于這個原因，研究者不妨在實驗設計中采取措施來控制這些效應，以增加對實驗結果的信心。
結語
目前，CRISPR基因組編輯技術現(xiàn)在已經(jīng)超越了實驗室，并且正在被開發(fā)為有望應用于多種適應癥的治療手段。OTE仍然是牽動CRISPR基因組編輯的臨床應用的主要問題。全基因組測序結合傳統(tǒng)的安全性評估可能是評估每種治療劑安全性的金標準。盡管如此，預先確定如何避免OTE的策略將有助于降低開發(fā)成本以及提高基于CRISPR的療法開發(fā)的成功率。
上述的體外小化OTE的策略也可以應用于體內CRISPR基因組編輯。據(jù)報道，CRISPR/Cas9基因組編輯后的OTE水平遠低于在細胞系中觀察到的水平，并且在大多數(shù)情況下，當使用當前優(yōu)化的檢測技術時，在測試的動物中沒有檢測到OTE的證據(jù)。
但總是存在引入OTE的機會，并且隨著CRISPR/Cas9在治療用途中的應用，任何OTE都可能對患者產(chǎn)生有害影響。隨著該技術更接近于臨床環(huán)境，我們需要有更穩(wěn)健、靈敏和有效的方法來確認OTE是否存在，以進一步增強其應用的可信度。
參考出處：
doi: 10.1016/j.jbiotec.2018.08.007
doi: 10.1093/nar/gkw1013
13224517959
