色谱柱-淋洗液罐-巴罗克试剂槽-巴氏吸管-5ml样品瓶-SBS液氮冻存管-上海希言科学仪器有限公司

大腸桿菌表達系統是發展zui早、目前zui為成熟的表達系統。因其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等，是基礎研究和商業生產重組蛋白的強大工具；但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點：如重組蛋白不穩定，生物活性低，以包涵體形式表達。外源基因在大腸桿菌中的表達效率受多個因素的影響，在表達前對目的蛋白進行分析和優化，才能實現目的蛋白的表達，主要包括如下幾個方面：

(1) 表達載體的選擇，表達載體啟動子的選擇很重要，啟動子的結構影響了它與 RNA 聚合酶的親和力，從而影響了基因表達的水平，理想的啟動子應該滿足：①具有強啟動性，能指導轉錄以保證目的蛋白的高產量；②可嚴謹調控，在一定條件下開始誘導表達，可zui大限度降低細菌的代謝負荷和外源蛋白的毒性作用。其他如 SD 序列位置和轉錄終止子，也會影響轉錄和翻譯效率。

(2) 密碼子優化，含有大量稀有密碼子的基因在大腸桿菌中表達時，由于大腸桿菌缺乏某幾種 tRNA，會降低 mRNA 的翻譯效率和穩定性，甚至會造成翻譯錯誤或提前中止。對目的基因進行密碼子改造，可以提高 mRNA 的穩定性和翻譯效率。
 

(3) 融合蛋白及分子伴侶，融合蛋白不僅可以作為親和標簽利于下游純化操作，而且大分子融合蛋白還能增加蛋白的可溶性表達，如谷胱甘肽-S 轉移酶 (GST),SUMO 蛋白，麥芽糖結合蛋白（MBP），親水性強，有助于提高靶蛋白的可溶性和穩定性；共表達分子伴侶可促進重組蛋白的翻譯后折疊加工，提高蛋白可溶性和穩定性。大腸桿菌系統中常用的有 GroEL 和 GroES 體系；熱休克蛋白 DnaK，DnaJ 和 GrpE 三元體系；Dsb 家族 (二硫鍵還原酶及異構酶)，能夠促進二硫鍵的形成。
(4) 靶蛋白的定位表達，重組蛋白在大腸桿菌中合成后有 4 種定位, 即胞質、周質空間、內膜或外膜和細胞外基質中。利用信號肽將重組蛋白分泌到細胞周質或胞外培養基中, 細胞周質空間的氧化環境利于二硫鍵的形成和硫基蛋白的正確折疊；周質空間中的蛋白酶要比胞內低很多，減少靶蛋白的降解；周質空間中的蛋白數量也較胞內少很多，利于靶蛋白的純化。

(5) 表達菌株的選擇，菌株內源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達產物的不穩定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株。Rosetta2 系列補充大腸桿菌缺乏的七種稀有密碼子對應的 tRNA（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC,GGA 及 CGG），提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統中的表達水平；K-12 衍生菌 Origami 2 系列，trxB 和 gor 雙突變菌株，顯著提高細胞質中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性表達。Rosetta-gami™則是綜合上述兩類菌株的優點，既補充 7 種稀有密碼子，又能夠促進二硫鍵的形成，幫助表達需要借助二硫鍵形成正確折疊構象的真核蛋白。
 

(6) 誘導條件，培養條件對重組蛋白的表達也很關鍵的，例如溫度，溫度較高時蛋白表達量高但容易形成包涵體，而溫度低時蛋白表達量低，但可以提高目的蛋白的可溶性；誘導物的濃度也同樣影響重組蛋白的表達效率，如低濃度 IPTG 誘導可以提高可溶蛋白的含量。另外培養基的營養成分，pH 和其它參數都可以影響蛋白酶的活性，分泌和表達水平。

在大腸桿菌中表達外源蛋白，表達前的分析非常重要，對目的基因和蛋白進行具體分析，綜合考慮，選擇的表達體系和方法，才能實現外源蛋白的表達。