色谱柱-淋洗液罐-巴罗克试剂槽-巴氏吸管-5ml样品瓶-SBS液氮冻存管-上海希言科学仪器有限公司

產品展示
PRODUCT DISPLAY
技術支持您現在的位置:首頁 > 技術支持 > PCR擴增產物的檢測分析
PCR擴增產物的檢測分析
  • 發布日期:2018-05-11      瀏覽次數:4058
    • PCR擴增反應完成之后,必須通過嚴格的鑒定,才能確定是否真正得到了準確可靠的預期特定擴增產物。凝膠電泳是檢測PCR產物常用和zui簡便的方法,能判斷產物的大小,有助于產物的鑒定。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳,前者主要用于DNA  pian段大于100bp者,后者主要用來檢測小片段DNA。

      1.瓊脂糖凝膠電泳

      這是實驗室zui常用的方法,簡便易行,只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時,由于泳動速度不同而被分離,經溴化乙錠(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。 
      用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

      (1)制膠

      瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來,過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml,稱取瓊脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波爐加熱2-5min,使瓊脂糖*溶解(注意不要暴沸),置室溫等溫度下降至60℃時,加入終濃度0.5μg/ml的EB液,充分混勻后倒板(注意排除氣體)。

      (2)加樣和電泳

      上樣時一般取PCR反應液5~10μl,加入3μl溴酚蘭液,充分混勻,加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE液,接通電源,使樣品由負極向正極移動。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。

      (3)檢測

      將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測,DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現,并與擴增時所設的陽性對照比較,判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照,判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

      2、聚丙烯酰胺凝膠電泳

      聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

      它與瓊脂糖凝膠電泳比較具有如下優點:

      ①分辨率很強,可達1bp;

      ②能裝載的DNA量大,達每孔10μgDNA;

      ③回收的DNA純度高;

      ④其銀染法的靈敏度較瓊脂糖中EB染色法高2~5倍;

      ⑤避免了EB迅速退色的弱點,銀染的凝膠干燥后可長期保存。

      聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA  pian段的有效范圍:

      (1)制膠

      在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片,放上制膠架,擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

      制備適量合適濃度的凝膠,使之略多于膠板。制備100μl體積凝膠的配制方法見下表。 

      不同濃度(%)聚丙酰胺凝膠的制法:

       

       

      試劑

      3.5%

      5%

      8%

      12%

      20%

      30%丙烯酰胺溶液(ml)

      11.6

      16.6

      26.6

      40

      66.6

      水(ml)

      67.7

      62.7

      26.6

      40

      66.6

      5×TBE(ml)

      20

      20

      20

      20

      20

      10%過硫酸銨(ml)

      0.7

      0.7

      0.7

      0.7

      0.7

      TEMED(ml)

      0.035

      0.035

      0.035

      0.035

      0.035

       

       

      在加入TEMED和10%過硫酸銨后,立即混勻,倒入放置45℃角的玻璃板內,*注滿(注意不要有氣泡),迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊,待30-60分鐘膠聚合后,取下膠板,放入電泳槽中固定。

      (2)加樣和電泳

      上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢過加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡,將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻,用微量注射器加入加樣孔底部,使樣品在孔底成一層,兩側孔中加入標準分子量的DNA Marker。

      以2-10V/cm電壓電泳,電泳時間足夠長,使片斷足以分開,待指示劑走到適宜位置時關閉電源,將膠片取出。

      (3)銀染

      分開兩塊玻璃板,將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min,雙蒸水洗3次,每次2min,然后將凝膠片轉入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min,吸去AgNO3液,用雙蒸水洗3次,每次30s,加入100ml顯色液約7-10min,待DNA帶顯示清除時,吸去顯色液,加入固定液Na2CO3,靜置2-3min,取出凝膠觀察。

    魏經理
    • 手機

      13224517959

    主站蜘蛛池模板: 小型手持气象站-空气负氧离子监测站-多要素微气象传感器-山东天合环境科技有限公司 | 工业用品一站式采购平台|南创工品汇-官网|广州南创 | 冷镦机-多工位冷镦机-高速冷镦机厂家-温州金诺机械设备制造有限公司 | 齿轮减速机电机一体机_齿轮减速箱加电机一体化-德国BOSERL蜗轮蜗杆减速机电机生产厂家 | 垃圾处理设备_餐厨垃圾处理设备_厨余垃圾处理设备_果蔬垃圾处理设备-深圳市三盛环保科技有限公司 | 欧美日韩国产一区二区三区不_久久久久国产精品无码不卡_亚洲欧洲美洲无码精品AV_精品一区美女视频_日韩黄色性爱一级视频_日本五十路人妻斩_国产99视频免费精品是看4_亚洲中文字幕无码一二三四区_国产小萍萍挤奶喷奶水_亚洲另类精品无码在线一区 | 游泳池设备安装工程_恒温泳池设备_儿童游泳池设备厂家_游泳池水处理设备-东莞市君达泳池设备有限公司 | 工业铝型材-铝合金电机壳-铝排-气动执行器-山东永恒能源集团有限公司 | RV减速机-蜗轮蜗杆减速机-洗车机减速机-减速机厂家-艾思捷 | 沈阳缠绕膜价格_沈阳拉伸膜厂家_沈阳缠绕膜厂家直销 | 膜结构_ETFE膜结构_膜结构厂家_膜结构设计-深圳市烨兴智能空间技术有限公司 | 警用|治安|保安|不锈钢岗亭-售货亭价格-垃圾分类亭-移动厕所厂家-苏州灿宇建材 | 礼仪庆典公司,礼仪策划公司,庆典公司,演出公司,演艺公司,年会酒会,生日寿宴,动工仪式,开工仪式,奠基典礼,商务会议,竣工落成,乔迁揭牌,签约启动-东莞市开门红文化传媒有限公司 | 塑料检查井_双扣聚氯乙烯增强管_双壁波纹管-河南中盈塑料制品有限公司 | 圈酒招商网【jiushuitv.com】_酒水招商_代理_加盟平台 | 预制直埋蒸汽保温管-直埋管道-聚氨酯发泡保温管厂家 - 唐山市吉祥保温工贸有限公司 | 通用磨耗试验机-QUV耐候试验机|久宏实业百科 | 酒吧霸屏软件_酒吧霸屏系统,酒吧微上墙,夜场霸屏软件,酒吧点歌软件,酒吧互动游戏,酒吧大屏幕软件系统下载 | 成都LED显示屏丨室内户外全彩led屏厂家方案报价_四川诺显科技 | 南京泽朗生物科技有限公司-液体饮料代加工_果汁饮料代加工_固体饮料代加工 | 北京晚会活动策划|北京节目录制后期剪辑|北京演播厅出租租赁-北京龙视星光文化传媒有限公司 | 彩超机-黑白B超机-便携兽用B超机-多普勒彩超机价格「大为彩超」厂家 | 新材料分散-高速均质搅拌机-超声波分散混合-上海化烁智能设备有限公司 | 临海涌泉蜜桔官网|涌泉蜜桔微商批发代理|涌泉蜜桔供应链|涌泉蜜桔一件代发 | 防火门|抗爆门|超大门|医疗门|隔声门-上海加汇门业生产厂家 | 红立方品牌应急包/急救包加盟,小成本好项目代理_应急/消防/户外用品加盟_应急好项目加盟_新奇特项目招商 - 中红方宁(北京) 供应链有限公司 | 低压载波电能表-单相导轨式电能表-华邦电力科技股份有限公司-智能物联网综合管理平台 | 电动高压冲洗车_价格-江苏速利达机车有限公司| MES系统工业智能终端_生产管理看板/安灯/ESOP/静电监控_讯鹏科技 | 微波消解仪器_智能微波消解仪报价_高压微波消解仪厂家_那艾 | 天助网 - 中小企业全网推广平台_生态整合营销知名服务商_天助网采购优选 | 「钾冰晶石」氟铝酸钾_冰晶石_氟铝酸钠「价格用途」-亚铝氟化物厂家 | 北京律师事务所_房屋拆迁律师_24小时免费法律咨询_云合专业律师网 | C形臂_动态平板DR_动态平板胃肠机生产厂家制造商-普爱医疗 | 【星耀裂变】_企微SCRM_任务宝_视频号分销裂变_企业微信裂变增长_私域流量_裂变营销 | 胜为光纤光缆_光纤跳线_单模尾纤_光纤收发器_ODF光纤配线架厂家直销_北京睿创胜为科技有限公司 - 北京睿创胜为科技有限公司 | 高低温试验箱-模拟高低温试验箱订制-北京普桑达仪器科技有限公司【官网】 | 哈尔滨京科脑康神经内科医院-哈尔滨治疗头痛医院-哈尔滨治疗癫痫康复医院 | Magnescale探规,Magnescale磁栅尺,Magnescale传感器,Magnescale测厚仪,Mitutoyo光栅尺,笔式位移传感器-苏州连达精密量仪有限公司 | 河南不锈钢水箱_地埋水箱_镀锌板水箱_消防水箱厂家-河南联固供水设备有限公司 | 建筑资质代办-建筑资质转让找上海国信启航 |