色谱柱-淋洗液罐-巴罗克试剂槽-巴氏吸管-5ml样品瓶-SBS液氮冻存管-上海希言科学仪器有限公司

產品展示
PRODUCT DISPLAY
技術支持您現在的位置:首頁 > 技術支持 > 實用哺乳動物細胞培養手冊(中)
實用哺乳動物細胞培養手冊(中)
  • 發布日期:2018-01-03      瀏覽次數:1591
    • 細胞培養環境

      1、實驗室設計 細胞培養是一種無菌操作技術,要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受 其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響, 要求工作環境清潔、空氣清新,干燥和無煙塵。細胞培養室的設計原則一般是無菌 操作區設在室內較少走動的內側,常規操作和封閉培養于一室,而洗刷消毒在另一 室。

      2、常用設施及設備

      (1)超凈工作臺:也稱凈化工作臺,分為側流式、直流式和外流式三大類。

      (2)無菌操作間:一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作 臺及二氧化碳培養箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及 消毒好的無菌物品等。

       

      (3)操作間:普通培養箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物

      (4)洗刷消毒間:烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

      (5)分析間:顯微鏡、計算機及打印機等。

      3、培養器皿 常用細胞培養器皿有培養瓶、培養板、培養皿等。常準備量是使用量的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、利于細胞粘附和生長的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品 或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。

      (1)液體儲存瓶:用于儲存各種配制好的培養液、血清等液體,常用規格有 500 ml、250 ml、100 ml 等幾種。

      (2)培養瓶:根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異,用于細胞傳代培養的細 胞要求瓶壁厚簿均勻,便于細胞貼壁生長和觀察,瓶口要大小一致,口徑一般不小于

      1 cm,允許吸管伸入瓶內任何部位,規格有 200 ml、100 ml、50 ml、25 ml、10 ml 等幾種。

      (3)培養皿:用于開放式培養及其它用途。分直徑 30 mm、60 mm、120 mm 等幾種。

      (4)吸管:常用的有長吸管和短吸管兩類,長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有 球型刻度稱改良吸管,刻度吸管用于移動液體。常用 1 ml 和 10 ml 兩種。短吸管也叫滴 管,分彎頭和直頭兩種。

      (5)離心管:離心管是細胞培養中使用zui廣泛的器皿,根據用途不同形態各樣,常用 于細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為 50 ml、

      30 ml、15 ml;后者則多為 10 ml 和 5 ml。

      (6)其它:如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

      4、細胞培養溫度

      維持培養細胞旺盛生長,必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細胞對培養溫度要求也不同。人體細胞培養的標準溫度為 36.5℃±0.5℃,偏離這一溫度范圍,細胞的正常代謝會受到影響,甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強,溫度上升不超過 39℃ 時,細胞代謝與溫度成正比;人體細胞在 39-40℃1 小時,即能受到一定損傷,但仍有 可能恢復;在 40-41℃1 小時,細胞會普遍受到損傷,僅小半數有可能恢復;41-42℃1 小 時,細胞受到嚴重損傷,大部分細胞死亡,個別細胞仍有恢復可能;當溫度在 43℃ 以上 1 小時,細胞全部死亡。相反,溫度不低于 0℃ 時,對細胞代謝雖有影響,但并無傷害作 用;把細胞放入 25-35℃ 時,細胞仍能生存和生長,但速度減慢;放在 4℃ 數小時后,再回到 37℃ 培養,細胞仍能繼續生長。細胞代謝隨溫度降低而減慢。當溫度降至冰點以下時,細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是,如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑(二甲亞砜或甘油),可在深低溫下如-80℃ 或-196℃(液氮)長期保存。

      5、合適的氣體環境

      氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧

      氣參與三羧酸循環,產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。 開放培養時一般把細胞置于 95% 空氣加 5% 二氧化碳混合氣體環境中。二氧化碳既是細胞代謝產物,也是細胞生長繁殖所需成分,它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基

      的 pH 值。大多數細胞的適宜 pH 為 7.2-7.4,偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。 但細胞耐酸性比耐堿性大一些,在偏酸環境中更利于細胞生長。但有一些細胞也喜歡偏 堿環境中生長,如成纖維細胞 pH 是 7.4-7.6。每種細胞都有其zui適 pH 值。

      細胞培養無菌操作基本技術

      無菌操作技術分為三個部分:工作環境及表面的處理,細胞培養所用玻璃及塑料制品的處理及培養液與培養細胞的處理。

      工作環境的處理 使用層流超凈工作臺是有效的手段。超凈工作臺正常工作時,向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超凈臺。

      (1)實驗前,無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射 30-60 分鐘滅菌,用 70% 酒精擦拭無菌 操作臺面,并開啟無菌操作臺風機運轉 10 分鐘后,才可開始實驗操作。每次操作只 處理一株細胞,以免造成細胞交叉污染。實驗結束后,將實驗物品帶出工作臺。如需 要繼續進行下一個實驗,則用 70% 酒精擦拭無菌操作臺面,再讓無菌操作臺風機運 轉 10 分鐘后,才可進行下一個實驗操作。

      (2)無菌操作工作區域應保持清潔與寬敞,必要物品,如試管架、移液器或吸管頭等可以 暫時放置,其它實驗用品用完后應及時移出,以利氣體流通。實驗用品要用 70% 酒精 擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在操作臺中央無菌區域內進行,勿在邊緣 非無菌區域操作。

      (3)小心取出無菌實驗用品,避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口,不要 在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,用手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約 45° 角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。

      (4)工作人員應注意自身的安全,必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性 或病毒感染的細胞株應特別小心,并選擇適當等級的無菌操作臺(至少兩級)。操作過 程中,應避免引起氣溶膠的產生,小心有毒性試劑,例如 DMSO 及 TPA 等,并避免尖 銳物品傷人等。

      (5)定期檢查下列項目:CO2 鋼瓶內的 CO2 壓力;CO2 培養箱內的 CO2 濃度、溫度、及水盤 是否有污染;無菌操作臺內氣流壓力是否正常,定期更換紫外燈管及 HEPA 過濾器濾膜, 預濾網 ﹙300 小時/預濾網,3000 小時/HEPA)。

      培養細胞生長過程:潛伏期→指數增生期→停滯期

      潛伏期 (latent phase)

      細胞接種后, 先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期. 此時, 細胞質回縮, 胞體呈圓球形. 然后細胞貼附于載體表面, 稱貼壁, 懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類, 培養基 成分, 載體的理化性質等密切相關。一般情況下,原代培養細胞貼壁速度慢, 可達 10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常 10-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期. 原代培養細胞潛伏期長,約 24-96 小時或更長, 連續 細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅需 6-24 小時。

      (2) 指數增生期 (logarithmic growth phase)

      這是細胞增殖zui旺盛的階段,分裂相細胞增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為 判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(Mitotic index, MI)表 示,即細胞群中每 1000 個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于 0.1%-0.5%,原 代細胞分裂指數較低,而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達 3%-5%。指數增生期 的細胞活力時期,是進行各種實驗*時期,也是凍存細胞的時機。在接種細 胞數量適宜情況下,指數增生期持續 3-5 天后,隨著細胞數量不斷增多、生長空間減少, zui后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動,這種現象稱接觸抑 制現象 (contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象,能繼續移動和增殖,導致 細胞向三維空間擴展,使細胞發生堆積(piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖然發生接 觸抑制,但只要營養充分,細胞仍能進行增殖分裂,因此細胞數仍然在增多。但是,當 細胞密度進一步增大,培養液中營養成分減少,代謝產物增多時,細胞因營養枯竭和代 謝產物的影響,導致細胞分裂停止,這種現象稱密度抑制現象(Density Inhibition)。

      (3)停滯期 (Stagnate phase)

      細胞數量達到飽和密度后,如不及時進行傳代,細胞就會停止增殖,進入停止期。此時 細胞數持平,故也稱平臺期(Plateau phase)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動。如 不進行分離傳代,細胞會因培養液中營養耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒,出 現形態改變,貼壁細胞會脫落,嚴重的會發生死亡,因此,應及時傳代。

      培養細胞基本形態

      培養細胞隨貼附支持物形狀不同而形態各異,zui常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的,結構不明顯。細胞在生長期常有 1-2 個核仁。在細胞機能狀態不良時,細胞輪廓會增強,反差增大。若胞質中時而出現顆粒、脫滴和腔 泡等,表明細胞代謝不良。

      體外培養細胞根據它們在培養器皿是否能貼附于支持物上生長特征,可分為貼附型生 長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養時能貼附在支持物表面生長。如羊水細胞為貼 附型細胞,常表現為成纖維型細胞和上皮細胞生長。懸浮型細胞在培養中懸浮生長。

      (1)成纖維型細胞 在培養中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時,皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相似而得名,細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長,細胞中央有卵園形核,胞質向外伸出 2-3 厘米個長短不同的突起,除真正的成纖維細胞外, 凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長。

      (2)上皮型細胞 此類型細胞在培養器皿支持物上生長具有扁平不規則多角形特征,細胞中央有園形核,細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養時,皆呈上皮型形態生長。

      (3)游走型細胞 本型細胞在支持物上散在生長,一般不連成片。細胞質經常伸出偽足或突起,呈活躍的游走或變形運動,速度快且不規則。此型細胞不很穩定,有時亦難和其它型細胞區別。在一定的條件下,由于細胞密度增大聯成片后,可呈類似多角型或成纖維細膩包形態。常 見于羊水細胞培養的早期。

    魏經理
    • 手機

      13224517959

    主站蜘蛛池模板: 预制舱-电力集装箱预制舱-模块化预制舱生产厂家-腾达电器设备 | 单机除尘器 骨架-脉冲除尘器设备生产厂家-润天环保设备 | 福建成考网-福建成人高考网 | 变色龙云 - 打包app_原生app_在线制作平台_短链接_ip查询 | 德国EA可编程直流电源_电子负载,中国台湾固纬直流电源_交流电源-苏州展文电子科技有限公司 | 清水混凝土修复_混凝土色差修复剂_混凝土色差调整剂_清水混凝土色差修复_河南天工 | 算命免费_生辰八字_免费在线算命 - 卜算子算命网| 药品/药物稳定性试验考察箱-埃里森仪器设备(上海)有限公司 | 气体检测仪-氢气检测仪-可燃气体传感器-恶臭电子鼻-深国安电子 | 【直乐】河北石家庄脊柱侧弯医院_治疗椎间盘突出哪家医院好_骨科脊柱外科专业医院_治疗抽动症/关节病骨伤权威医院|排行-直乐矫形中医医院 | 【电子厂招聘_普工招工网_工厂招聘信息平台】-工立方打工网 | 定量包装机,颗粒定量包装机,粉剂定量包装机,背封颗粒包装机,定量灌装机-上海铸衡电子科技有限公司 | 洁净棚-洁净工作棚-无菌室-净化工程公司_北京卫护科技有限公司 | 新疆散热器,新疆暖气片,新疆电锅炉,光耀暖通公司 | 伟秀电气有限公司-10kv高低压开关柜-高低压配电柜-中置柜-充气柜-欧式箱变-高压真空断路器厂家 | 编织人生 - 权威手工编织网站,编织爱好者学习毛衣编织的门户网站,织毛衣就上编织人生网-编织人生 | 不锈钢散热器,冷却翅片管散热器厂家-无锡市烨晟化工装备科技有限公司 | 房屋质量检测-厂房抗震鉴定-玻璃幕墙检测-房屋安全鉴定机构 | 打包箱房_集成房屋-山东佳一集成房屋有限公司 | 北京燃气公司 用户服务中心| 鑫达滑石-辽宁鑫达滑石集团 | QQ房产导航-免费收录优秀房地产网站_房地产信息网 | 德国进口电锅炉_商用电热水器_壁挂炉_电采暖器_电热锅炉[德国宝] | 安徽成考网-安徽成人高考网 | 理化生实验室设备,吊装实验室设备,顶装实验室设备,实验室成套设备厂家,校园功能室设备,智慧书法教室方案 - 东莞市惠森教学设备有限公司 | 薪动-人力资源公司-灵活用工薪资代发-费用结算-残保金优化-北京秒付科技有限公司 | 小型铜米机-干式铜米机-杂线全自动铜米机-河南鑫世昌机械制造有限公司 | SDI车窗夹力测试仪-KEMKRAFT方向盘测试仪-上海爱泽工业设备有限公司 | ptc_浴霸_大巴_干衣机_呼吸机_毛巾架_电动车加热器-上海帕克 | 密集架-手摇-智能-移动-价格_内蒙古档案密集架生产厂家 | 机械加工_绞车配件_立式离心机_减速机-洛阳三永机械厂 | 硅PU球场、篮球场地面施工「水性、环保、弹性」硅PU材料生产厂家-广东中星体育公司 | 防爆大气采样器-防爆粉尘采样器-金属粉尘及其化合物采样器-首页|盐城银河科技有限公司 | POS机办理_个人POS机免费领取 - 银联POS机申请首页 | WTB5光栅尺-JIE WILL磁栅尺-B60数显表-常州中崴机电科技有限公司 | MES系统-WMS系统-MES定制开发-制造执行MES解决方案-罗浮云计算 | 干式变压器厂_干式变压器厂家_scb11/scb13/scb10/scb14/scb18干式变压器生产厂家-山东科锐变压器有限公司 | 柔性输送线|柔性链板|齿形链-上海赫勒输送设备有限公司首页[输送机] | 武汉高低温试验机-现货恒温恒湿试验箱-高低温湿热交变箱价格-湖北高天试验设备 | 工作心得_读书心得_学习心得_找心得体会范文就上学道文库 | 锻造液压机,粉末冶金,拉伸,坩埚成型液压机定制生产厂家-山东威力重工官方网站 |