色谱柱-淋洗液罐-巴罗克试剂槽-巴氏吸管-5ml样品瓶-SBS液氮冻存管-上海希言科学仪器有限公司

免疫學的發展史起始于微生物學研究，于18世紀建立，19 世紀至 20 世紀中期進入經典發展期。這一時期，人們對免疫功能的認識由人體現象的觀察進入了科學實驗時期。20世紀初期到中期，進入近代免疫學時期。從20世紀中期開始，真正進入現代免疫學時期?，F代免疫學的檢測基本歷經了以下幾個過程，如圖1所示。

圖1.免疫檢測技術的發展史

免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測，利用同位素、酶、化學發光物質等對檢測信號進行放大和顯示，常被用于檢測蛋白質、激素等微量物質。各類免疫學檢測方法的性質及發展狀況詳見表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據著非常重要的地位，但是從我國臨床免疫診斷現狀來看，其步伐都落后于發達國家，亟待改進。

表1. 各類免疫檢測技術的性質及優缺點

化學發光技術是近二、三十年來發展起來的一種測定方式。該技術的原理是利用化學反應釋放的自由能激發中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發態回到基態。當中間體從激發態回到基態時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而進行定量分析（見圖2）?；瘜W發光具有熒光的特異性，同時不需要激發光，避免了熒光分析中激發光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環境污染和健康危害，是一種非常的定量分析方法。

圖2. 化學發光基本原理示意圖

化學發光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測定技術，凡具有抗原性的物質（包括半抗原）都可以用CLIA測定。CLIA起步于80年代初，快速發展于90年代具備以下特點 ：
①高度敏感，極限達10-17－10-19mol/L，遠高于放射性免疫（RIA）、酶聯免疫（EIA）。與時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當，但比TRFIA便宜。
②特異性強，重復性好CV＜10％。
③測定范圍寬，可達7個數量級。
④試劑穩定性好，無污染有效期12月。
⑤操作簡單，易于自動化。
磁微粒化學發光免疫分析是將磁性分離技術、化學發光技術、免疫分析技術三者結合起來的一種新興分析方法，其基本原理見圖3 。該技術充分利用了磁性分離技術的快速易自動化性，化學發光技術的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領域展現了不可替代的作用。

圖3. 磁微?；瘜W發光免疫檢測（雙抗夾心法）原理示意圖

目前磁微?；瘜W分析免疫分析已經應用于管式化學發光免疫檢測項目以及電化學發光免疫檢測項目。

能夠用于化學發光免疫分析的磁珠種類

按材質分：

按照官能團分：

海貍磁珠應用于化學發光免疫檢測機理

磁珠用于化學發光領域的方法

間接法

間接法就是包被抗原，然后用酶標記的抗抗體檢測樣本中抗體，基本原理見圖4，適合于檢測對象是自身抗體的情況。間接法的優點：相對較方便，只要變換包被抗原就可以檢測不同的項目。間接法的缺點：標本中的特異性抗體會競爭性的結合抗原，使結果出現假陰性。

圖4. 采用間接法進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標抗抗體孵育，清洗。
d)加發光底物，檢測信號。

捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定，因此測定IgM抗體多用捕獲法?；驹砣鐖D5所示，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測定特異性IgM。

圖5. 采用捕獲法進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合洗滌。
d)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合洗滌。
e)加底物顯色，檢測信號。

固相抗原競爭法

競爭法，是指受檢抗體和酶標抗體競爭性的與磁珠表面抗原結合。固相抗原競爭法基本原理如圖6所示。結合于固相載體的酶標抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無抗體，酶標抗體能夠順利與抗原結合，出現強信號。若受檢樣本中有抗體，則競爭性的占去了酶標抗體與抗原的結合，酶標抗體的結合力減弱，信號強度減弱。

圖6. 采用固相抗原競爭法進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標本和酶標抗原的混合液孵育。
c)加發光底物，檢測信號。

雙抗夾心（兩步法）

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，基本原理如圖7所示。

圖7. 采用雙抗夾心法（兩步法）進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜。
b)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時問，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
c)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量成正相關。
d)加發光底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

雙抗夾心法（一步法）

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hook effect），類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果（如圖8， 雙抗夾心法及雙位點一步法。缺點：假陰性）

圖8. 采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發光檢測基本原理

圖9. 采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發光檢測，當樣本中抗原量較多是，容易出現假陰性。

操作步驟：

a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標二抗孵育，清洗。
c)加發光底物，檢測信號。

海貍產品優勢

的表面技術

蘇州海貍生物醫學工程有限公司，掌握先進的生物納米表面技術，能夠保證蛋白的覆蓋率、有效控制蛋白質的定向包被、充分表露蛋白的活性位點。生物納米表面技術成功將生物技術與納米技術融合，明顯改善一些生物材料表面的非特異性吸附現象。通過近4年的技術沉淀，已經申請相應12篇。

海貍公司生物納米表面技術，能夠保證蛋白的定向性，以及活性位點的充分暴露。
左圖普通技術包被的磁珠，表面抗體呈現雜亂無章，保持5%-10%的抗體活性。
右圖海貍公司采用定向包被技術，保證抗體的活性端充分暴露，保持抗體100%的活性。

自主研發磁珠

作為大、種類zui全的磁珠生產商之一，蘇州海貍生物醫學工程有限公司以的生物納米表面技術和生物試劑技術為核心，開發了一系列生物醫用磁珠及試劑盒。其中，磁珠類產品線囊括了多個領域，包括特異性標記與捕獲，蛋白快速分離與純化，核酸提取與文庫構建，及高通量、自動化生物樣本處理綜合技術平臺。目前，海貍公司已經發展成為一家集自主研發、規?；a和于一體的生物醫學工程領域高科技企業。

海貍公司磁珠的微觀形貌

a）Mag COOH-2000掃描電鏡顯微鏡圖，該磁珠的粒徑分布均一，為2微米。表面光滑，能夠降低部分非特異性吸附。
b）Mag NH2-500偶聯SA蛋白后的掃描電鏡顯微鏡圖片。采用海貍納米科技表面技術包被的SA磁珠能夠保證SA蛋白的均勻包被，且避免磁珠的粘連。
c）磁性瓊脂糖微球的顯微鏡成像圖片。采用納米級磁核，填充于30-150μm的瓊脂糖微球內，形成載量*的微球。對抗體的結合量達30mg/mL磁性微球。
d）將Magrose NHS磁珠偶聯熒光蛋白后，在熒光顯微鏡中成像圖片。該磁珠能夠促使蛋白均勻分布，且保證蛋白的利用效率。

海貍磁珠（BeaverBeads™）在化學發光領域的應用

可用于化學發光領域的磁珠，種類如前面第三章所列。但其中，鏈霉親和素磁珠的使用，主要是因為親和素-生物素系統的通用型以及廣泛性。親和素-生物素系統（BAS）的主要特點如下列表。

海貍鏈霉親和素磁珠，是采用蘇州海貍生物醫學工程納米表面技術，將重組鏈霉親和素蛋白高密度定向包被到超順磁性微球表面，排列均勻，并朝向一致。產品具有較高的生物素結合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附。每mg磁珠的游離生物素結合量高達800pmol以上，生物素化抗體結合量為20μg以上。

海貍鏈霉親和素磁珠化學發光實驗結果

在配合全自動化學發光儀進行檢測時，體現出很好的穩定性，以及與進口品牌磁珠相當的靈敏性。

檢測方法：雙抗夾心兩步法

結論

BeaverBeadsTMStreptavidin具有很好的穩定性能，CV值控制在5%以內與進口磁珠相當。
BeaverBeadsTMStreptavidin對非特異性具有良好的控制，S0明顯低于進口磁珠。
BeaverBeadsTMStreptavidin的靈敏度較高，Ratio（S/0）比值控制在2.0，與進口磁珠相當。